在 ADC研发进程中，内吞检测是验证候选抗体活性、保障药物疗效的关键环节 —— 您是否正被这些问题困扰：
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检测信号弱到无法区分内化水平？
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方法单一难以适配多场景验证？
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试剂批间差异大导致重复实验成本高？
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针对ADC内吞检测，目前的检测试剂通常存在信噪比较高的问题——这不仅会掩盖真实内吞信号，还会导致我们无法区分内吞水平不同的候选药物。
为解决以上问题，ACROBiosystems百普赛斯开发并验证了一种利用pH敏感的内吞检测试剂(Cat. No. IGG-PZF2001)，适用于快速评估抗体的内吞过程。该试剂具有高信噪比的特点以及能够帮助我们获得更大的检测窗口。在流式细胞术（FACS）和细胞成像实验中，较传统试剂检测灵敏度更高，能捕捉微弱内化信号。
我们通过荧光显微镜成像和流式细胞术，利用该试剂评估HER2阳性贴壁细胞和CD20 阳性悬浮细胞中的抗体内化水平，探究了试剂浓度、孵育时间等关键实验参数，并评估了这些参数对荧光信号和内吞效率的影响。
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内吞检测试剂特异性验证
检测方法：荧光显微镜成像
检测仪器：EVOS M7000 成像系统
细胞：SK-BR-3
检测结果：
荧光显微镜观察显示，仅实验组细胞的内体区室中出现强荧光信号（图1C）；而对照组（无抗体组或加入同型对照抗体组）仅呈现极低水平的背景信号（图1A-B）。这种依赖抗体的荧光分布模式清晰表明，内吞作用信号是由靶标抗体结合特异性介导产生的。Z 轴堆叠扫描进一步证实了这一结论：结果显示内吞作用试剂信号（红色）与溶酶体标志物（绿色）存在高度共定位，且未检测到细胞外信号（图 1D）。
图1 A:内吞作用检测试剂（货号：IGG-PZF2001）;B:IgG1 同型对照抗体 - 内吞作用检测试剂偶联物;C:抗 HER2 抗体 - 内吞作用检测试剂偶联物;D:抗 HER2 抗体 - 内吞作用检测试剂偶联物（Z 轴堆叠扫描成像）
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流式细胞术检测ADC内吞作用
此外，我们在 HER2 阳性和 CD20 阳性两种细胞系中均开展了流式细胞术分析。
检测方法：流式细胞术
检测仪器：BD Biosciences FACS Lyric
细胞：SK-BR-3、Raji
主要试剂：
图2 抗体内吞作用的流式细胞术（FACS）分析：A. HER2 阳性细胞系中 HER2 特异性抗体曲妥珠单抗（红色）的检测结果B. CD20 阳性细胞系中 CD20 特异性抗体利妥昔单抗（红色）的检测结果。蓝色：IgG1 同型对照抗体的检测结果
检测结果：
结果表明，该内吞作用检测试剂不仅适用于多种细胞类型的抗体内吞评估，还可通过流式细胞术实现快速且定量的分析（图 2A-B）。
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内吞检测试剂浓度优化
为明确内吞检测试剂（IGG-PZF2001）的最佳工作浓度，我们在CD20阳性与HER2阳性细胞系中开展系统性评估：固定一抗浓度为 2µg/mL，同步设置检测试剂浓度梯度（1µg/mL、2µg/mL、4µg/mL）。
剂量依赖性分析显示：随检测试剂浓度从 1µg/mL 升至 4µg/mL，阳性信号显著增强，但 4µg/mL 高浓度会导致对照组背景信号同步升高。综合信噪比（SNR）分析表明，两种细胞系中均以 “1µg/mL 检测试剂 + 2µg/mL 一抗”（1:2 比例）实现检测灵敏度与背景抑制的最佳平衡（图 3 A-D）。
这一优化后的条件为后续的内吞作用检测实验建立了一套可靠且经济高效的实验方案。
图3 不同检测试剂浓度下抗体内吞作用的流式细胞术（ACS）分析。A：CD20 阳性细胞系中的检测试剂对照组；B：CD20 阳性细胞系中检测试剂与 CD20 特异性抗体利妥昔单抗（Rituximab）共孵育组；空白组（Blank）：仅含细胞；红色（Red）：1 μg/mL检测试剂；蓝色（Blue）：2 μg/mL检测试剂；紫色（Purple）：4 μg/mL检测试剂；C：HER2 阳性细胞系中的检测试剂对照组；D：HER2 阳性细胞系中检测试剂与 HER2 特异性抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）共孵育组；空白组（Blank）：仅含细胞；红色（Red）：1 μg/mL检测试剂；蓝色（Blue）：2 μg/mL检测试剂；绿色（Green）：4 μg/mL检测试剂
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内吞检测试剂孵育时间优化
为探究抗体内吞动力学规律，我们将抗体-试剂复合物分别与 CD20 阳性、HER2 阳性细胞系共孵育（30 分钟至 4 小时），并通过流式细胞术分析荧光信号变化。结果显示，内吞动力学呈现显著细胞类型依赖性：
✏️ CD20 阳性细胞：整个孵育周期内，荧光强度随时间呈持续增长；
✏️ HER2 阳性细胞：表现为双相反应特征 —— 前2小时荧光信号变化极小，孵育至4小时时信号显著增强（图 4 A-D）。
这些不同的动力学模式证实了我们的内吞检测试剂可通过定量荧光变化可靠地监测动态内吞过程，同时还能揭示内吞速率的靶标特异性差异。
图4 不同孵育时间下抗体内吞的FACS分析。A：CD 20+细胞系中的检测试剂对照。B：CD 20+细胞系中的检测试剂和CD 20特异性抗体利妥昔单抗。C：HER2+细胞系中的检测试剂对照。D：HER2+细胞系中的检测试剂和HER2特异性抗体曲妥珠单抗。空白：仅细胞。红色：30 min，蓝色：1 h，紫色：2 h，绿色：4 h。
本研究结果强调了建立细胞系特异性检测窗口的重要性，因为最佳检测时间点可能会因靶抗原和细胞环境的不同而存在显著差异。这种时间特征分析为未来应用中的实验设计提供了关键指导，同时也强调：对于每一种新的抗体-细胞系统组合，都应通过实验确定其内吞动力学，以确保准确评估内吞效率。
ACROBiosystems
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